随着对细胞凋亡的研究和认识的不断深入，对包括肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本的细胞凋亡的检测已成为一种迫切需要。目前，多种方法已得到较广泛的应用。然而如何选择适当的方法并对检测的结果作出正确的判断及愉如其分的解释仍是值得探讨的问题。本文简要评述几种常用的细胞凋亡检测方法。
一、细胞凋亡的形态学观察
细胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特征。目前对细胞凋亡的认识正不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法。
光学显微镜观察
凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指标之一。
检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。
视频时差显微技术（videotime-lapsemicroscopy）
本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织。
检测方法：收集2×105细胞/ml培胞，置于多孔培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔分钟30秒作序列摄影，连续24小时。如同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观察和摄影。
电子显微镜观察
关于凋亡细胞的超微结构特征，包括透射电镜和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽描述。凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳的体现。为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。本方法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。由于样品范围局限，在凋亡细胞数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变。还应指出的是，在观察体外培养的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡小体很少见到，出现较多的是凋亡初期胞体收缩、染色质边聚和后期凋亡小体（或整个凋亡细胞）被吞噬和降解的现象。一些不典型的改变容易被忽略，在观察时要特别予以注意。
检测方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。
流式细胞技术
流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性（granu-larity）有关。细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变。早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。
细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptoticpeak）,代表凋亡细胞。根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。
检测方法：获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流式细胞仪分析。
二、细胞凋亡的细胞化学测定
细胞凋亡的细胞化学测定包括细胞表面（细胞膜）的结构和通透性改变的测定和细胞核DNA改变的测定。根据应用的范围，又可分为细胞群休和单个细胞测定两种，以下仅介绍其中几种较为常用的方法。
碘化丙啶（propidiumiodide,PI）检测
早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI)不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
检测方法：获取11×106细胞/ml的细胞悬液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm）,后者荧光为蓝色（480nm）。正常细胞蓝色最强。早期凋亡细胞由于DNA的漏出蓝色稍弱并有少量的红色荧光，晚期凋亡细胞红色荧光加强。坏死细胞红色荧光最强。
膜联蛋白（annexin）V标记
正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。PS表面化发生于凋早期，其机制尚不清，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表现PS结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜PS的表面化。结合PI染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），早期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜联蛋白V标记仅有不到三分之一的凋亡细胞出现阳性标记，其原因尚不明。同时需注意度的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色。
检测方法：1×106细胞/ml细胞悬液，先后用膜联蛋白V--FITC及PI染色，流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（cytogram），每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数在所点的组份。左下象限代表正常细胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡细胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+）,左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（An-PI+）。用生物素标记膜联蛋白V还可以作体内试验。将生物素标记膜联蛋白V注射小鼠体内，30分钟后处死，迅速取出要研究的组织置于甲醛内固定，然后，常规石蜡切片，脱蜡、水化，用亲和素标记的过氧化物酶程程序孵育，DAB显色，光镜下观察凋亡细胞。
DNA琼脂凝胶电泳法
细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，DNA在核小体间被切割成180-200bp整数倍的单或寡核苷酸片段，在电泳时表现为特征性的“梯形带”。自Wyllie把内源性核酸内切酶降解产生“梯形带”与细胞凋亡相联系以来，“梯形带”被作为细胞凋亡的一个重要的生化指标。尽管有报道指出，实验中出现典型的形态改变时可不伴有核小体间的DNA降解，对这一指标提出质疑，本方法仍被广泛应用。但此方法敏感性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能被用于细胞群体，不能用于组织的原位检测。
检测方法：培养细胞清洗、离心，加入细胞裂解液裂解，高速离心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已锭的1％-2％的琼脂糖凝胶的样品的孔中进行电泳，最后在紫外线灯下观察和摄影。
DNA裂解的原位检测
在细胞水平检测DNA裂解的原位标记技术已越来越多地被用于组织切片和培养细胞，细胞凋亡时，由于DNA的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量大的DNA上形成单的继裂（缺口，nick）。此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苷酸在3`-OH端予以显示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脱氧核苷酸转移酶（TdT），前者使核苷酸结合于缺口，需要模板存在，标记方法通常被称为“原位缺口平移”(insitunicktranslation,ISNT),后者使核苷酸在双链的断端延伸，不需要模板的存在，其方法被称为未端记（endlabeling）、加尾法（tailingreaction）或TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）。上述方法，尤其是TUNEL的应用已很广泛，其优点是可用于原位标记，可用于病理组织，并可进行定量分析。值得注意的是坏死期由于内源性核酸内切酶和蛋白质酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出现阳性反应。组织或细胞外理不当时可出现假阳性。因而，TUNEL等方法对凋亡细胞的标记是选择性的。而不是特异性的，TUNEL或其他DNA裂解原位标记的分析应结合阳性细胞的形态，尤其是核的特征，细胞的分布和有无炎症反应，除外非凋亡的阳性反应。
检测方法：石蜡切片常规脱蜡、水化，蛋白质酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，显色（辣根过氧化物酶标记可用DAB显色，碱性磷酸酶标可用NBT+BCIP显色），复染，脱水，封片。凋亡细胞核呈现蓝色（NBT+BCIP显色）或者棕黄色（DAB显色）。
凋亡蛋白质酶（Caspase）-3及其底物的检测
凋亡蛋白质酶是一类半胱氨酸蛋白质酶，具有特异性水解底物分子天冬氨酸（Asp）残七C端肽键功能，是近年随着调亡研究的深入而发现的重要凋亡分子。迄今已有13个分子得到命名，分别为凋亡蛋白质酶1-13。基中凋亡蛋白质-3是被认为在多种组织、细胞类型中最常涉及的凋亡效应分子。活化的凋亡蛋白质酶-3仅在凋亡细胞中发现，因此，检测凋亡蛋白质酶-3的活性有助于发现早期的凋亡细胞。一般采用人工合成四肽荧光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白质酶-3在D与AMC之间水解，释放荧光物质、AMC，后者在紫外线激发下发出波长为430-460nm的荧光，通过流式细胞仪或分光光度计对其强度进行定量，从而测定凋亡蛋白质酶-3的活性。由于醛对凋亡蛋白质酶-3的水解活性抑制作用，因此同时加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白质酶-3对DEVD-AMC的水解，不产生荧光。这样的抑制试验可作为对照，使凋亡蛋白质酶-3的活性分析更有特异性。但是，上述方法不适用于组只切片，因此有人尝试采用针对活化的凋亡蛋白质酶-3亚基的抗体，通过免疫组化显示凋亡细胞，然而其敏感性及特异性尚不能令人满意。
检测方法：培养细胞（也可以预先作凋亡诱导并在不同时段收集细胞）在裂解液内裂解、离心、去上清液。加入凋亡蛋白质酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同时用不加底物的样品作对照，流式细胞仪检测，加有底物的样品释放出的荧光强度样对照样品明显增强。如加入DEVD-AMC时再加入DEVD-CHO，样品释放的荧光强度与对照样品无差异。
凋亡蛋白质酶-3导致细胞凋良心是通过水解或灭活一些细胞关键蛋白质实现的，因此检测凋亡蛋白质酶-3底物的改变也有助于辨认细胞的凋亡。PARP是第一个被认识的凋亡蛋白质酶-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000及相对分子质量为25000的两个片段，用运载相对分子质量为85000片段的抗体可以观察细胞是否发生凋亡。细胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白质酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸残基形成一个新的抗原表位，用抗此表位的抗体可以在组织切片上辨认凋亡细胞。另外一种细胞骨架蛋白质肌动蛋白（actin）被水解后产生一种称为“fractin”的片段，在凋亡早期出现，并认为与细胞膜的起泡有关，可能有助于早期凋亡细胞的辨认。总之，随着对凋亡蛋白质酶及其底物的进一步研究，将会发现更有价值的有助于检测凋亡细胞的方法。
三、展望
除了以上介绍的几种较常用检测细胞凋亡的方尖，还有一些尚未被列入的检测方法，新的方法正将出现。尽管用于检测细胞凋亡的方法较多，但形态学观察，尤其是透射电镜观察仍具有不可替代的作用，只是其应用受到一定限制。在细胞化学检测方法中，迄今没有任何一种方法具有足够的敏感性和特异性，尤其在病理组织中要作出准确定量分析仍较为因难。在目前情况下标本和病变的特点，选择多种适当的方法进行综合检测，常可行到较准确结果，同样重要的是，要充分理解各种方法的原理及应范围，并对结果作出合理的分析和判断。随着对细胞凋亡认识的深化和有关技术的进展，期待更敏感、更特异的方法面世，这对于病理状态（包括肿瘤）中细胞凋亡的研究将具有重要意义。
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