1、抗肿瘤血管生成在肿瘤治疗中的意义
早在1971年JudahFolkman博士就首次阐明了抗肿瘤血管生成在肿瘤治疗中具有重要意义。随后,大量的研究证实肿瘤细胞生长和转移依赖于肿瘤血管的生成,肿瘤血管承担着输送营养物质和排泄废物的作用,并间接促进肿瘤细胞的增殖,而且为肿瘤细胞提供了转移的通道,促进了肿瘤的恶性进展。Folkman曾提出在肿瘤发生和发展过程中存在“血管生成开关机制”,在肿瘤生长的最初阶段,抑制肿瘤血管生成的因素仍占优势,无肿瘤血管生成,肿瘤细胞生长缓慢即血管前期(肿瘤生长休眠期,体积<110～210mm3),但随着肿瘤细胞不断分裂增殖突变,具备通过多个途径诱导肿瘤组织新生血管生成,促进肿瘤血管生成的因素逐渐占优势,使肿瘤细胞能够获得足够的营养物质,肿瘤细胞的增殖快于凋亡,肿瘤生长进入血管期(快速的增值期,瘤体积增大,浸润、转移,有诱导血管生成的能力)。通过控制肿瘤血管生成,切断肿瘤细胞的营养供应,可抑制肿瘤生长并能减少肿瘤浸润转移的机会,故而抑制新生肿瘤血管生成的疗法有望成为治疗肿瘤的重要方法。近年来,大量的实验研究发现,许多蛇毒的活性成分能够通过作用于肿瘤血管生成的不同环节而发挥抗肿瘤血管生成和抗转移的作用。
2、解离素抗肿瘤血管生成的作用机制及特点
2.1解离素的分类
解离素(disintegrin)是一类从蛇毒或水蛭毒素中提取的一类同源性很高的多肽,半胱氨酸含量丰富,分子质量为5～9kDa的小分子多肽。根据活性中心的3个氨基酸序列的不同可分为精-甘-天冬氨酸解离素(RGD-disintegrin)、赖-甘-天冬氨酸解离素(KGD-disintegrin)、蛋-亮-天冬氨酸解离素(MLD-disintegrin)、赖-苏-丝氨酸解离素解离素(KTS-disintegrin)等。其中RGD-disintegrin种类最多,如triflavin,disBa201,accutin,salmosin,contortrostatin等。根据解离素多肽链的长短又可分为短链解离素,中链解离素和长链解离素。从结构上可分为单体解离素和二聚体解离素。二聚体解离素又可分同二聚体解离素和异二聚体解离素。
2.2解离素是细胞表面整合素受体的阻断剂
解离素含有精-甘-天冬氨酸(RGD)序列或赖-甘-天冬氨酸(KGD)序列等,细胞周围的基质蛋白也含有RGD序列。细胞表面有一种称为整合素的受体,可以识别细胞外基质蛋白中的RGD序列并与之结合,解离素亦可与整合素受体结合而竞性抑制这一过程,使肿瘤细胞及血管内皮细胞和细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的高黏附性遭到破坏,从而抑制肿瘤的生长、浸润、转移及肿瘤血管的生成。
2.3血管生成过程及解离素抗肿瘤血管生成的作用机制
血管生成过程实际上就是沿着血管排列的血管内皮细胞增殖的过程。正常的血管生成在胚胎发育过程中的器官形成和伤口恢复中的组织重塑中起重要的作用,在这些生理条件之下,血管生成受到了严格的调控,而病理的血管生成,特别是肿瘤条件下的血管生成呈持续、失控性的过程。
肿瘤血管生成的过程可概括为:肿瘤细胞分泌血管生成因子如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)等→血管生成因子与血管内皮细胞结合→血管内皮细胞被激活并增殖→血管内皮细胞与ECM黏附→ECM降解→血管内皮细胞迁移,进入肿瘤实质内→血管管腔生成→血管袢的生成及肿瘤血管的建立。
其中整合素在血管内皮细胞迁移分化过程中起到重要的调节作用,各种体外、体内实验表明,许多的内皮细胞整合素对血管生成过程中的细胞生长、移行、连接起重要作用。这些整合素包括α1β1、α2β1、α4β1、α5β1、α6β1、α6β4、α9β1、αvβ3、αvβ5等,其中αvβ3和αvβ5整合素尤为重要,两者机制不同,但都是与配体分子中的RGD肽结合而发挥促进血管生成的作用。在肿瘤血管生成过程中,血管内皮细胞与ECM的结合可为内皮细胞的迁移开辟通路。研究发现血管内皮细胞表面在肿瘤血管生成时有大量αvβ3整合素受体,这种整合素受体同时黏附金属蛋白酶(metalloproteinase,MMP)和ECM,发挥MMP靶向降解ECM,为血管内皮细胞迁移提供便利,同时使以储存形式而无生物学活性的VEGF从ECM中释放出来并具有生物活性,特异性地进一步激活血管内皮细胞。一般情况下,血管内皮细胞只有少量αvβ3整合素表达,在肿瘤血管生成时,血管内皮细胞αvβ3整合素的表达明显增加,如阻断αvβ3与ECM的结合,则血管内皮细胞发生凋亡,血管生成减少,肿瘤转移减少。
有研究表明肿瘤细胞与ECM结合可进一步促进肿瘤细胞分泌血管生成因子以持续支持血管的生成。
综上所述由整合素介导的细胞与ECM的黏附在肿瘤血管生成过程中起至关重要的作用,而多种蛇毒解离素是细胞表面整合素受体有效的阻断药,具有显著的抗肿瘤血管生成的作用。解离素通过阻断血管内皮细胞与ECM的黏附,不仅可抑制内皮细胞的迁移,还可因减少ECM的降解,进一步减少基质中VEGF的释放,从而避免内皮细胞的进一步激活和迁移。另外,还可减少肿瘤细胞分泌血管生成因子,从而抑制肿瘤血管的生成。
2.3解离素抗肿瘤血管生成的实验研究进展
解离素具有较强的抗肿瘤血管生成的活性。Yeh等从尖吻蝮蛇毒中提取的一种解离素accutin,具有抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)黏附和迁移的作用,血管生成实验及鸡胚绒毛尿囊膜模型(chickchorioallantoicmembranemodel,CAMmodel)表明accutin具有体内外抗肿瘤血管生成的作用。Sheu等通过解离素triflavin(提纯于trimeresurusflavoviridis蛇毒毒液,可阻断αvβ3-integrin的生理作用)对HUVEC的作用,首次阐明蛇毒解离素具有抗肿瘤血管生成的作用。αvβ3-integrin在肿瘤血管生成时显著高表达,比较triflavin和抗αvβ3抗体在抗血管生成的作用时,发现triflavin比单克隆抗体至少强20～30倍,甚至含解离素结构域的物质同样有抗肿瘤血管生成的作用,如Ren等通过重组获得解离素结构域agkistin-s,具有抗肿瘤血管生成及诱导血管内皮细胞凋亡的作用。从Macroviperalebetinatransmediterranea蛇毒中提取一种类解离素且半胱氨酸丰富的蛋白质leberagin2C,具有抑制αvβ3-integrin介导的肿瘤细胞的黏附作用及肿瘤血管生成作用。
解离素对不同整合素的阻断作用具有相对选择性。来源于蝰蛇的KTS-(obtustatin,viperistatin,lebestatin)和RTS-(jerdostatin)是α1β1-integrin的有效的阻断药,抑制其与胶原蛋白Ⅰ、Ⅳ的结合,具有抗肿瘤血管生成的作用。DisBa-01可抑制高表达αvβ3-integrin的人微血管内皮细胞株1(humanmicrovascularendothelialcellline-1,HMEC-1)和鼠黑色素瘤细胞株B16F10与玻璃体结合蛋白的黏附,但对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(该细胞株不表达αvβ3-integrin)的黏附无影响,体内实验显示DisBa-01能抑制碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)诱导的肿瘤血管生成和黑色素瘤的转移。重组解离素DisBa-01,来源于Bothropsalternatus蛇毒毒腺的cDNA,为单体解离素,同样具有很强的抗肿瘤转移及抗肿瘤血管生成的作用。从铜头蝮蛇的毒液种提取的一种同源二聚体解离素(contortrostatin,CN),可结合整合素的β1、β3和β5亚基,故可竞争性地抑制整合素与纤维连接蛋白(α5β1)、玻璃体结合蛋白(ανβ3,ανβ5)和纤维蛋白原(α2bβ3)的结合。CN的这种多靶向抑制多种整合素的活性能更好地抑制肿瘤的生长和播散,是CN的一个特点。在肿瘤动物模型中,CN被证实具有抗浸润,抗肿瘤血管生成和抗转移的活性。例如,一项研究观测CN对HUVEC的迁移、浸润和血管生成活性的影响,发现3种活性都被抑制达90%。免疫组化显示HUVEC的血管内皮钙黏素(VE2cadherin)亦受CN的抑制。
给药方式的改进大大提高了解离素抗肿瘤血管生成的活性。Kim等成功地将解离素salmosin的基因置入阳离子脂质体,经皮下注射,转染后该基因在老鼠体内表达,salmosin可抑制老鼠黑色素瘤细胞的生长和肺转移。saxatilin为一种蛇毒解离素,已被证实具有较强的抗肿瘤血管生成作用,可抑制血小板的聚集及bFGF诱导的HUVEC的增殖作用,并且抑制玻璃体粘连蛋白诱导的血管平滑肌细胞的迁移,白细胞介素12(IL212)是公认的能增强Th1型抗肿瘤免疫应答并抗肿瘤血管生成。Park等通过脂质体转染,将脂质体saxatilin基因和(或)IL212基因瘤体内注射,结果显示共转染两种基因比单独转染其中一种基因的抗肿瘤血管生成作用更强。Minea等获得重组的单链解离素CN,成功地包埋于单层脂质体中,形成脂质体contortrostatin(liposomalcontortrostatin,LCN),对移植有人乳腺癌细胞MDA2MB2435的小鼠的抗肿瘤及抗肿瘤血管生成的能力显著增强。比较LCN与天然CN的药代动力学、血小板反应性和免疫原性,发现了LCN的几点优势:①LCN的半衰期更长;②LCN在瘤内被动蓄积;③LCN没有血小板反应性;④LCN不被免疫系统识别。这一研究将为contortrostatin等解离素投入临床使用提供指导。
解离素与其他抗肿瘤药物联合应用可提高治疗效果。Miltyk等将解离素与苯丙氨酸氮芥合用能增强抗肿瘤作用,其机制包括细胞毒性作用及抑制整合素介导的细胞信号通路。
解离素抗肿瘤血管生成治疗无明显耐药性及不良反应。关于CN的急性毒性试验是在犬模型中进行的,在测试剂量对心率、心电图、血凝等未见明显的影响。慢性毒性试验是在裸鼠中进行的,分2组2种给药方式:将CN直接瘤体注射,qd,6～8周;脂质体CN直接注射,隔日1次,也6～8周,未见内出血等不良反应,说明小鼠能耐受CN的长期治疗。对韩国Gloydiussaxatilis蛇毒的重组解离素saxatilin进行毒性实验表明,在抗肿瘤血管生成等治疗时,未见明显毒性反应。多项研究表明,解离素抗肿瘤治疗一般无耐药性,并且无血压,体温等方面的不良反应发生。
3、结语
目前临床上应用的抗肿瘤血管生成药物主要是单克隆抗体,应用单克隆抗体较易产生耐药性。贝伐单抗能特异性地抑制VEGF-A信号通路,当VEGA-A信号被阻断时,其他信号通路包括VEGA家族的其他成员被诱导从而取代VEGF-A信号通路。肿瘤本身亦会通过低氧耐受等机制而对抗抗肿瘤血管生成药物的作用。
在肿瘤迁移、黏附、浸润、转移和肿瘤血管生成过程中,整合素起关键性作用。解离素能多靶向地同时抑制多种整合素的活性,能更好地抑制肿瘤血管的生成并降低了耐药性。另外解离素是小分子质量多肽,不刺激免疫系统,减少了不良反应的发生。大量重组解离素的出现提高了产量,降低了成本,不断改进的给药途径(如脂质体),都使解离素可能在未来的抗肿瘤治疗中取代传统的抗肿瘤血管生成药物。
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